1、器材

牛肉膏蛋白胨培養基，培養皿（6套一包），手提式高壓蒸汽菌鍋等。2、操作步驟

1．shou先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

2．放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。

3．加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

4．用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力**所需時間。本實驗用1．05kg/cm2，121．3℃，20分鐘滅菌。

5．滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降**0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。

6．將取出的滅菌培養基放入37℃溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。

稀釋倒平板法

先將待分離的材料用無菌水作一系列的稀釋（如1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000…），然后分別取不同稀釋液少許，與已溶化并冷卻**45℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可出出菌落。如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨后挑取該單個菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。倒平板的兩種方法持皿法

⑴將若干無菌培養皿疊放在左側，便于拿取。

⑵點燃煤氣燈，將火焰調到適中（空氣不要太大，以免氣流過急）。

⑶倒平板時，先用左手握住三角瓶的底部，傾斜三角瓶，用右手旋松棉塞，然后用右手的小指和手掌邊緣夾住棉塞并將它拔出（切勿將棉塞放在桌面上），隨之將瓶口周緣在火焰上過一下（不可灼燒，以防爆裂，以殺死可指沾在瓶口外的雜菌。然后將三角瓶從左手傳**右手中（用右手的拇指、食指和中指拿住三角瓶的底部），在這操作過程中瓶口應保持在離火焰2~3處，瓶口始終向著火焰。左手拿起一套培養皿，用中指、無名指和小指托住培養皿底部，用食指和大拇指夾住皿蓋并開啟一縫，恰好能讓三角瓶伸入，隨后倒出培養基。一般約倒入12ml的培養基即可鋪滿整個皿底。蓋上皿蓋，置水平位置等凝。然后再將三角瓶移**左手，瓶口再次過火并塞緊棉塞。

平板培養基的冷凝方法有兩種，一種是將平板一個個攤開在桌面上冷凝，另一方法是將幾個平板疊在一起冷凝。前者冷凝速度較快，在室溫較高時采用；而后者冷凝速度較慢，可在室溫較低時采用，其優點是形成冷凝水少，尤其適用于平板劃線等的需要。

疊皿法

此法步驟與持皿法基本相同。不同點是左手不必持培養皿，而是將培養皿疊放在煤氣燈的左側并靠近火焰，用右手拿住三角瓶的底部，左手的掌背對著瓶口，用小指與無名指夾住瓶塞，將其拔出，隨即使瓶口過火，同時用左手開啟**上面的皿蓋，倒入培養基，蓋上皿蓋即移**水平位置待凝。再依次倒下面的平板。在操作過程中，瓶口應向著火焰保持傾斜狀，以防空氣中微生物的污染。